Ect2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401538-ACT

Das humane Gen **ECT2** kodiert **epithelial cell transforming 2 (Ect2)**, einen Rho-Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF), der **RhoA**, **Rac1** und **Cdc42** aktiviert, um den Umbau des Aktin-Zytoskeletts und die Zytokinese zu koordinieren. Ect2 wird während des Zellzyklus dynamisch reguliert und lokalisiert in den Zellkern sowie an mitotische Strukturen, wo es die Ausbildung der Teilungsfurche, spindelassoziierte Signalgebung und die Aufrechterhaltung der epithelialen Polarität steuert. Über die Rho-GTPase-Signalübertragung beeinflusst Ect2 Prozesse wie Zellmigration, Adhäsion und Proliferation, die mit Signalwegen zur Genomstabilität und mitotischen Genauigkeit verknüpft sind. Eine Fehlregulation der ECT2-Expression oder -Aktivität wurde mit Phänotypen der onkogenen Transformation in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext von Tumorzellinvasion und aberranter Zellteilung untersucht.

Ect2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ECT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ect2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ECT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ECT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ect2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ECT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ect2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ect2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ECT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.