EAAT3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401539-ACT

SLC1A1 codiert den exzitatorischen Aminosäuretransporter 3 (EAAT3), einen hochaffinen, natriumabhängigen Transporter für Glutamat und Aspartat, der dazu beiträgt, die extrazellulären Konzentrationen exzitatorischer Aminosäuren zu regulieren und die intrazelluläre Verfügbarkeit von Glutamat für den Stoffwechsel und die Redoxhomöostase zu sichern. Die EAAT3-Aktivität trägt zur Clearance von Neurotransmittern, zur Aufrechterhaltung der Homöostase synaptischer Signalübertragung und – über glutamatabhängige Signalwege, die mit der Cysteinaufnahme und der Glutathionsynthese verknüpft sind – zur neuronalen Anfälligkeit gegenüber oxidativem Stress bei. In humanen Geweben ist SLC1A1 mit neuronalen und epithelialen Transportprozessen verbunden und wurde im Kontext veränderter exzitatorischer Neurotransmission sowie zellulärer Stressantworten untersucht. Genetische und expressionsbezogene Veränderungen in SLC1A1 wurden mit neuropsychiatrischen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Zusammenhang gebracht, was mechanistische Studien zur Regulation des Transporters und zu nachgeschalteten Signalwegen motiviert.

EAAT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC1A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EAAT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC1A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC1A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EAAT3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC1A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EAAT3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EAAT3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC1A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.