E2F1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400123-ACT

E2F1 (E2F-Transkriptionsfaktor 1) ist ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor, der den G1/S-Übergang steuert, indem er die Expression von Genen koordiniert, die für DNA-Replikation, Nukleotidstoffwechsel und Zellzyklusprogression erforderlich sind. Seine Aktivität wird streng über die RB/E2F-Achse reguliert, die mitogene Signale mit der Checkpoint-Kontrolle verknüpft, und sie steht zudem in Wechselwirkung mit p53-abhängiger Apoptose sowie DNA-Schadensantworten. Eine dysregulierte E2F1-Signalgebung ist häufig mit unkontrollierter Proliferation, Replikationsstress und genomischer Instabilität verbunden, wie sie bei Krebs und anderen proliferativen Erkrankungen zu beobachten sind. Da E2F1 außerdem Apoptose-, Seneszenz- und Differenzierungsprogramme beeinflussen kann, wird es häufig genutzt, um kontextabhängige Entscheidungen über das Zellschicksal zu untersuchen.

E2F1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen E2F1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

E2F1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des E2F1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der E2F1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen E2F1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native E2F1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von E2F1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des E2F1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem E2F1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.