E2F-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400851-ACT

E2F4 kodiert den humanen Transkriptionsfaktor E2F-4, einen zentralen Regulator der Genexpression im Zellzyklus, der typischerweise zusammen mit DP-Proteinen und Repressoren der RB-Familie wirkt, um den Übergang von G0/G1 in die S‑Phase zu steuern. E2F-4 ist an DREAM- und taschenproteinassoziierten Komplexen beteiligt, die die Repression und die zeitlich abgestimmte Aktivierung von Genen koordinieren, die an DNA-Replikation, mitotischer Progression und Checkpoint-Kontrolle beteiligt sind. Über seine Rolle in proliferativen Signalwegen und Differenzierungsprogrammen kann eine veränderte E2F4-Aktivität zu einer Fehlregulation der Zellzykluskontrolle, genomischer Instabilität und onkogenen transkriptionellen Zuständen beitragen. E2F-4‑abhängige transkriptionelle Netzwerke werden daher in der Krebsbiologie, bei Seneszenz sowie in Entwicklungszusammenhängen, in denen Zellzyklusaustritt und -wiedereintritt streng reguliert sind, intensiv untersucht.

E2F-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen E2F4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

E2F-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des E2F4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der E2F4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen E2F-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native E2F4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von E2F-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des E2F-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem E2F4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.