DUSP27 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404063-ACT

DUPD1 kodiert das Mitglied der Dual-Specificity-Phosphatase-Familie DUSP27, ein Protein, das an der Regulation phosphorylierungsabhängiger Signalwege beteiligt ist, indem es Serin/Threonin- und Tyrosinreste auf Zielproteinen moduliert. Eine mit DUSP27 assoziierte Aktivität steht mit der Kontrolle kinasegetriebener Signalwege in Verbindung, die zelluläre Differenzierung, Organisation des Zytoskeletts und stressresponsive Signalprogramme koordinieren. In menschlichen Geweben wurde die Expression von DUSP27 im Zusammenhang mit Muskelentwicklung und -remodellierung untersucht, wobei ein verändertes Gleichgewicht von Phosphatasen und Kinasen die kontraktile Funktion und Zellzustandsübergänge beeinflussen kann. Eine fehlregulierte Signalübertragung innerhalb der DUSP-Familie ist allgemein relevant für Erkrankungen, die durch abweichende Aktivität MAPK-assoziierter Signalwege und eine gestörte Phosphorylierungshomöostase gekennzeichnet sind, was den Einsatz von DUSP27-Störungsmodellen für mechanistische Studien unterstützt.

DUSP27 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DUPD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DUSP27 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DUPD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DUPD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DUSP27-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DUPD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DUSP27-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DUSP27-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DUPD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.