DND1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404161-ACT

Humanes DND1 (dead end protein homolog 1) ist ein RNA-bindendes Protein, das die posttranskriptionelle Genexpression reguliert, indem es spezifische Sequenzmotive in Ziel-mRNAs erkennt und deren Stabilität und Translation moduliert. Es ist vor allem für seine Funktionen in der Entwicklung von Keimzellen und der Aufrechterhaltung der zellulären Identität bekannt, einschließlich der Koordination von RNA-Schicksalsentscheidungen, die Proliferations-, Differenzierungs- und Überlebensprogramme beeinflussen. DND1 ist an Netzwerken beteiligt, die sich mit der microRNA-vermittelten Regulation überschneiden, indem es den Zugang von microRNAs zu ausgewählten Transkripten einschränkt und dadurch während der Entwicklung die proteomischen Ausgaben mitprägt. Eine Fehlregulation der DND1-abhängigen RNA-Kontrolle wurde in Modellsystemen mit veränderter Keimbahnbiologie und tumorassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was DND1 für Studien zu onkogener Reprogrammierung, Zellschicksalsübergängen und RNA-regulatorischen Schaltkreisen relevant macht.

DND1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DND1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DND1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DND1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DND1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DND1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DND1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DND1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DND1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DND1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.