DNA pol γ CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422341-ACT

Polg kodiert die DNA‑Polymerase gamma, die katalytische Polymerase, die in Maus­zellen für die Replikation und Reparatur der mitochondrialen DNA verantwortlich ist. Die DNA‑Pol γ arbeitet mit akzessorischen Untereinheiten zusammen, um die mtDNA‑Erhaltung zu sichern, und verknüpft damit die oxidative Phosphorylierungskapazität mit der mitochondrialen Biogenese, der Stabilität der Nukleoide und Stressantworten des Organells. Störungen oder eine veränderte Aktivität in der POLG‑Achse sind mit mtDNA‑Depletion oder der Akkumulation von Deletionen assoziiert und können Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion modellieren, die für neuromuskuläre und metabolische Krankheitsmechanismen relevant sind. Polg wird daher häufig genutzt, um die Integrität des mitochondrialen Genoms, die Dynamik der Replikationsgabel und retrograde Signalwege zu untersuchen, die mitochondriale Defekte mit nukleären Transkriptionsprogrammen koppeln.

DNA pol γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Polg-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Polg-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Polg-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol γ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Polg-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol γ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol γ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Polg-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.