DNA pol δ 4 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-408268-ACT-2

Das humane Gen POLD4 kodiert die Untereinheit 4 der DNA-Polymerase delta (Pol δ4), eine akzessorische Komponente des Pol-δ-Holoenzyms, die die hochpräzise DNA-Synthese am Folgestrang während der Replikation unterstützt und zur DNA-Reparatursynthese beiträgt. Als Teil der Replikationsmaschinerie wirkt POLD4 in zentralen Signal- und Prozesswegen, die das Fortschreiten der Replikationsgabel, die Prozessierung von Okazaki-Fragmenten und Checkpoints zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität steuern, und koordiniert dabei mit der PCNA-abhängigen Polymeraseaktivität. Ein verändertes Gleichgewicht der Pol-δ-Untereinheiten oder Replikationsstress unter Beteiligung von POLD4 wurde mit einer erhöhten Mutationslast und chromosomaler Instabilität in Verbindung gebracht, Merkmale, die häufig bei Krebs und anderen Erkrankungen der Genomwartung zu beobachten sind. Auf POLD4 ausgerichtete Geneditierung und Funktionsassays ermöglichen Untersuchungen zur Assemblierung des Polymerasekomplexes, zur Wahl zwischen Replikations- und Reparaturwegen sowie zu den zellulären Folgen einer beeinträchtigten Genauigkeit der DNA-Synthese in humanen Modellsystemen.

DNA pol δ 4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLD4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol δ 4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLD4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLD4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol δ 4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLD4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol δ 4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol δ 4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLD4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.