DNA pol δ 3 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-411506-ACT-2

Das menschliche Gen POLD3 kodiert die Untereinheit 3 der DNA-Polymerase delta (DNA-Pol δ 3), eine akzessorische Komponente des Polymerase-δ-Holoenzyms, die die prozessive DNA-Synthese steigert und die PCNA-abhängige Replikation des Folgestrangs unterstützt. POLD3 trägt zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität bei, indem es an DNA-Reparatur und Schadentoleranz beteiligt ist, darunter die DNA-Neusynthese während der homologen Rekombination sowie weitere replikationsgekoppelte Reparaturprozesse, die ins Stocken geratene Replikationsgabeln stabilisieren. Eine Störung der POLD3-Funktion wurde mit Replikationsstress, einer erhöhten Mutationslast und genomischer Instabilität in verschiedenen Krebskontexten in Verbindung gebracht, was POLD3 für Untersuchungen zur Tumorevolution und zu Abhängigkeiten von DNA-Reparaturmechanismen relevant macht. Auf POLD3 abzielende Gen-Editing-Werkzeuge sind nützlich, um replikationsgekoppelte Reparaturwege zu analysieren, synthetisch letale Interaktionen innerhalb des DNA-Schadensantwortnetzwerks zu kartieren und Auswirkungen auf Zellzyklusprogression und Genomintegrität in humanen Zellmodellen zu benchmarken.

DNA pol δ 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol δ 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol δ 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol δ 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol δ 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.