DNA pol α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402762-ACT

POLA1 kodiert die katalytische Untereinheit der humanen DNA-Polymerase alpha (DNA-Pol α), einer mit der Primase assoziierten Polymerase, die für den Start der chromosomalen DNA-Replikation essenziell ist, indem sie RNA–DNA-Primer verlängert, die an Replikationsursprüngen und am Folgestrang synthetisiert werden. Diese Funktion rückt POLA1 in den Kern des Programms zur Replikationsinitiation: Es koordiniert mit der Origin-Lizenzierung und dem Aufbau des Replisoms, um den Verlauf der S‑Phase und die Genomstabilität zu sichern. Störungen der DNA-Pol-α‑Funktion können Replikationsstress, veränderte Fork-Dynamiken und nachgeschaltete DNA-Schadensantworten fördern, die mit Checkpoint-Signalwegen und Mechanismen der Chromatin-Erhaltung verknüpft sind. POLA1 wurde mit Erkrankungen in Verbindung gebracht, die auf einer gestörten Nukleinsäuremetabolisierung und Immun-Signalgebung beruhen, und wird häufig im Kontext der Kontrolle von Zellproliferation sowie replikationsassoziierter Genominstabilität untersucht.

DNA pol α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.