DNA-PK_CS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400337-ACT

PRKDC kodiert die katalytische Untereinheit der DNA‑abhängigen Proteinkinase (DNA‑PKCS), einen zentralen Regulator der DNA‑Schadensantwort, der die Erkennung von DNA‑Enden mit deren Reparatur koppelt. DNA‑PKCS bildet zusammen mit dem Ku70/Ku80‑Heterodimer das DNA‑PK‑Holoenzym und koordiniert das nicht‑homologe End‑Joining (NHEJ), wodurch die Reparatur von Doppelstrangbrüchen, die V(D)J‑Rekombination und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität gefördert werden. Durch Autophosphorylierung sowie die Phosphorylierung zahlreicher Reparatur‑ und Signalfaktoren ist DNA‑PKCS mit der ATM/ATR‑Signalgebung, Replikationsstress‑Antworten und dem Chromatin‑Remodeling vernetzt. Eine dysregulierte PRKDC‑Aktivität oder ‑Expression steht im Zusammenhang mit veränderter Strahlenempfindlichkeit, Immundefizienz‑Phänotypen und genomischer Instabilität, wie sie in verschiedensten Forschungszusammenhängen zu Krebs und Neurodegeneration beobachtet werden.

DNA-PKCS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKDC-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA-PKCS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKDC-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKDC-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA-PKCS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKDC-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA-PKCS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA-PKCS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKDC-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.