DMRT1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424507-ACT

Dmrt1 kodiert DMRT1, einen konservierten Transkriptionsfaktor mit DM-Domäne, der für die männliche Geschlechtsbestimmung und die postnatale Differenzierung des Hodens in der Maus erforderlich ist. DMRT1 reguliert Genexpressionsprogramme in Sertoli- und Keimzellen, die das Schicksal von Spermatogonien aufrechterhalten, einen unangemessenen Eintritt in die Meiose verhindern und durch stadienspezifische transkriptionelle Kontrolle die testikuläre Identität bewahren. Es ist in entwicklungsbiologische Signalnetzwerke und chromatinvermittelte Regulation eingebunden, die die Musterbildung der Gonaden, die Zellzyklusprogression und die Festlegung der Zelllinie koordinieren. Eine Störung oder Fehlregulation von Dmrt1 wird mit Störungen der Geschlechtsentwicklung und beeinträchtigter Spermatogenese in Verbindung gebracht, wodurch es ein zentrales Ziel für die Erforschung der Reproduktionsbiologie und gonadaler tumorrelevanter Signalwege in experimentellen Modellen darstellt.

DMRT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dmrt1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DMRT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dmrt1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dmrt1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DMRT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dmrt1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DMRT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DMRT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dmrt1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.