Dkk-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420004-ACT

Das murine Dkk1-Gen kodiert Dickkopf-1 (Dkk-1), einen sekretieren Antagonisten der kanonischen Wnt/β‑Catenin-Signalübertragung, der an LRP5/6 bindet und Wnt-getriebene Transkriptionsprogramme begrenzt. Durch die Modulation der Wnt-Aktivität beeinflusst Dkk-1 die embryonale Musterbildung, die Osteoblastendifferenzierung und Knochenhomöostase sowie das Gewebe-Remodeling. Eine veränderte Dkk1-Expression wird mit einer dysregulierten Wnt-Signalwegaktivität in Verbindung gebracht, wie sie etwa bei Skelettphänotypen, fibroseassoziierter Signalgebung und Interaktionen in der Tumormikroumgebung beobachtet wird, wodurch Dkk1 einen nützlichen Knotenpunkt für die Analyse des Signalwegs darstellt. Dkk1 wird außerdem im Hinblick auf seine Effekte auf das Verhalten von Stamm-/Vorläuferzellen sowie auf die Wechselwirkungen mit Entzündungs- und Wachstumsfaktor-Netzwerken untersucht.

Dkk-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dkk1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dkk-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dkk1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dkk1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dkk-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dkk1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dkk-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dkk-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dkk1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.