DHODH CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402983-ACT

Humanes **DHODH** kodiert die Dihydroorotat-Dehydrogenase, ein flavinabhängiges Enzym der inneren Mitochondrienmembran, das den vierten Schritt der de-novo-Pyrimidinbiosynthese katalysiert, indem es Dihydroorotat zu Orotat oxidiert und dabei den Elektronentransfer über Ubichinon an die Atmungskette koppelt. Durch die Steuerung der intrazellulären Verfügbarkeit von Pyrimidinnukleotiden unterstützt DHODH die DNA-/RNA-Synthese, das Fortschreiten des Zellzyklus sowie die metabolische Anpassung unter proliferativen und Stressbedingungen. Die DHODH-Aktivität ist mit dem mitochondrialen Redoxgleichgewicht und Signalwegen der Nukleotidhomöostase verknüpft, die Reaktionen auf Replikationsstress beeinflussen. Eine fehlregulierte Pyrimidinmetabolisierung und die DHODH-abhängige bioenergetische Kopplung wurden mit der Biologie proliferativer Erkrankungen und der Aktivierung von Immunzellen in Verbindung gebracht, wodurch DHODH in Studien zur metabolischen Verwundbarkeit einen häufigen mechanistischen Knotenpunkt darstellt.

DHODH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DHODH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DHODH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DHODH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DHODH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DHODH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DHODH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DHODH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DHODH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DHODH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.