DEPTOR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402253-ACT

DEPTOR (DEP-Domäne enthaltendes, mit MTOR interagierendes Protein) ist ein endogener Inhibitor der mTOR-Signalübertragung, der sowohl an die mTORC1- als auch an die mTORC2-Komplexe bindet und beide moduliert. Indem DEPTOR die Phosphorylierungsoutputs feinjustiert, die Proteinsynthese, Autophagie, Stoffwechsel und Zytoskelettdynamik steuern, trägt es dazu bei, Wachstums- und Überlebensprogramme nachgeschaltet an Nährstoff- und Wachstumsfaktorsignale zu koordinieren. Eine veränderte DEPTOR-Expression wurde mit der dysregulierten Aktivität des PI3K–AKT–mTOR-Netzwerks in verschiedenen krankheitsassoziierten Kontexten in Verbindung gebracht, darunter Krebsbiologie und metabolische Stressantworten. Als Knotenpunkt, der die Aktivität der mTOR-Komplexe mit einer Feedback-Regulation koppelt, wird DEPTOR häufig hinsichtlich seiner Auswirkungen auf Zellproliferation, Apoptoseempfindlichkeit und adaptive Umverdrahtung von Signalwegen untersucht.

DEPTOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DEPTOR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DEPTOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DEPTOR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DEPTOR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DEPTOR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DEPTOR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DEPTOR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DEPTOR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DEPTOR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.