Plasmide CRISPR d'Activation (h) DEC1: sc-402058-ACT

BHLHE40 code le facteur de transcription bHLH (basic helix-loop-helix) DEC1, un régulateur contextuel de l’expression génique qui intègre des signaux environnementaux tels que l’hypoxie et les signaux circadiens. DEC1 module des programmes transcriptionnels liés au contrôle du cycle cellulaire, à la différenciation, à la transition épithélio-mésenchymateuse et à l’adaptation métabolique, et interagit avec des voies de signalisation incluant HIF-1 ainsi que les réseaux centraux de l’horloge circadienne. Par ces fonctions, DEC1 contribue à la régulation des réponses au stress et de l’expression de gènes inflammatoires, avec des associations rapportées à la biologie tumorale, au remodelage lié à la fibrose et à la dérégulation immunitaire dans divers systèmes expérimentaux.

DEC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BHLHE40 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DEC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BHLHE40 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BHLHE40, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DEC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BHLHE40 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DEC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DEC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de BHLHE40 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.