DDX29 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405089-ACT

DHX29 (DDX29) kodiert einen humanen DEAH-Box‑RNA-Helikase‑ähnlichen Faktor, der an der Translationsinitiation beteiligt ist und dabei effizientes ribosomales Scannen sowie die Auswahl des Startcodons auf strukturierten mRNAs unterstützt. Durch die Modulation des Verhaltens des 43S‑Präinitiationskomplexes trägt DDX29 zur Proteom‑Homöostase bei und kann zelluläre Stressanpassungsprogramme beeinflussen, die mit dem RNA‑Stoffwechsel gekoppelt sind. Störungen von Translationsinitiationsfaktoren und RNA‑Helikase‑Netzwerken sind häufig mit veränderter Wachstumskontrolle und proteotoxischen Stressantworten verknüpft, wodurch DHX29 einen relevanten Knotenpunkt für mechanistische Studien zur krankheitsassoziierten translationalen Reprogrammierung darstellt. Die Biologie von DHX29 ist außerdem in Kontexten von Interesse, in denen Veränderungen der mRNA‑Struktur oder der Initiationseffizienz die Expression von Regulatoren in Zellzyklus‑, Differenzierungs‑ und Stresssignalwegen neu gestalten.

DDX29 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DHX29-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DDX29 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DHX29-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DHX29-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DDX29-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DHX29-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DDX29-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DDX29-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DHX29-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.