Plasmide CRISPR d'Activation (h) DDX29: sc-405089-ACT

DHX29 (DDX29) code un facteur humain de type hélicase ARN à domaine DEAH, impliqué dans l’initiation de la traduction, où il favorise un scanning ribosomal efficace et la sélection du codon de démarrage sur des ARNm structurés. En modulant le comportement du complexe de pré‑initiation 43S, DDX29 contribue à l’homéostasie du protéome et peut influencer des programmes d’adaptation au stress cellulaire couplés au métabolisme de l’ARN. La perturbation des facteurs d’initiation de la traduction et des réseaux d’hélicases ARN est fréquemment associée à un contrôle de la croissance altéré et à des réponses au stress protéotoxique, ce qui fait de DHX29 un nœud pertinent pour des études mécanistiques sur la reprogrammation translationnelle liée aux maladies. La biologie de DHX29 présente aussi un intérêt dans des contextes où des changements de structure des ARNm ou d’efficacité d’initiation remodèlent l’expression de régulateurs des voies du cycle cellulaire, de la différenciation et du stress.

DDX29 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DHX29 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDX29 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DHX29 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DHX29, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDX29. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DHX29 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDX29 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDX29 dans les cellules tumorales présentant une expression de DHX29 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.