Plásmido CRISPR de Activación (h) DDIT3/CHOP/GADD153: sc-400051-ACT

DDIT3, también conocido como CHOP/GADD153, codifica un factor de transcripción bZIP inducible por estrés que integra señales de la respuesta a proteínas mal plegadas y de la respuesta integrada al estrés. Se induce con fuerza aguas abajo de PERK–eIF2α–ATF4 durante el estrés del retículo endoplásmico y modula programas transcripcionales que controlan la apoptosis, la autofagia, el equilibrio redox y la regulación del ciclo celular. DDIT3 influye en los desenlaces adaptativos frente a los terminales del estrés al alterar la expresión de genes implicados en el plegamiento de proteínas, el metabolismo de aminoácidos y la función mitocondrial. La desregulación de la señalización de DDIT3 se ha vinculado a la supervivencia de células cancerosas bajo estrés proteotóxico, a fenotipos de estrés metabólico y neurodegenerativo, y a eventos de fusión oncogénica como FUS–DDIT3 en el liposarcoma mixoide.

DDIT3/CHOP/GADD153 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DDIT3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DDIT3/CHOP/GADD153 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DDIT3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DDIT3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DDIT3/CHOP/GADD153. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DDIT3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DDIT3/CHOP/GADD153 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DDIT3/CHOP/GADD153 en células tumorales con expresión de DDIT3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.