DAX-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402180-ACT

NR0B1 kodiert DAX-1, einen verwaisten nukleären Rezeptor, der vor allem als transkriptioneller Koregulator in steroidogenen Geweben wirkt und dabei nukleäre Rezeptor-Signale mit Entwicklungsprogrammen integriert. DAX-1 moduliert Gene, die an der Differenzierung von Nebenniere und Gonaden sowie an der Biosynthese von Steroidhormonen beteiligt sind, einschließlich der Regulation von Transkriptionsnetzwerken, die von Steroidogenic Factor 1 (NR5A1/SF-1) abhängig sind. Über seine Effekte auf Zellschicksalsentscheidungen und die endokrine Homöostase trägt DAX-1 dazu bei, Proliferation und Differenzierung in der Nebennierenrinde und in reproduktiven Zelllinien zu steuern. Eine Fehlregulation von NR0B1 ist mit der X-chromosomal vererbten kongenitalen Nebennierenhypoplasie und dem hypogonadotropen Hypogonadismus assoziiert, was es zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der endokrinen Entwicklung und der Transkriptionsregulation macht.

DAX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NR0B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DAX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NR0B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NR0B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DAX-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NR0B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DAX-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DAX-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NR0B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.