DARPP-32 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400430-ACT

PPP1R1B codifica DARPP-32 (fosfoproteina di 32 kDa regolata da dopamina e cAMP), un integratore cruciale della segnalazione dopaminergica e glutamatergica nei neuroni. Quando viene fosforilata dalla PKA, DARPP-32 inibisce la protein fosfatasi 1, modulando così gli stati di fosforilazione a valle che plasmano la plasticità sinaptica, le risposte trascrizionali e l’eccitabilità neuronale. Questa regolazione collega PPP1R1B alla segnalazione cAMP/PKA, alle vie dipendenti dal calcio e alle reti di fosforilazione guidate dai recettori nei neuroni spinosi medi dello striato. Un’espressione o una fosforilazione alterata di DARPP-32 è spesso studiata nel contesto dei meccanismi delle malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative, nonché delle alterazioni della trasduzione del segnale nella biologia tumorale.

DARPP-32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP1R1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DARPP-32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP1R1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DARPP-32. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP1R1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DARPP-32 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DARPP-32 nelle cellule tumorali con espressione di PPP1R1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.