DAAO CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402772-ACT

Das humane **DAO**-Gen kodiert die D‑Aminosäureoxidase (DAAO), ein peroxisomales Flavoprotein, das die oxidative Desaminierung neutraler D‑Aminosäuren katalysiert und dabei die entsprechenden Iminosäuren, Wasserstoffperoxid und Ammoniak erzeugt. Durch die Regulation der Spiegel von D‑Serin und verwandten Metaboliten beeinflusst DAAO die Verfügbarkeit des NMDA‑Rezeptor‑Koagonisten und verknüpft den Aminosäurestoffwechsel über den peroxisomenassoziierten Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies mit der Redoxhomöostase. Diese Achse überschneidet sich mit Neurotransmission, zellulären Antworten auf oxidativen Stress und der metabolischen Homöostase in Gehirn und peripheren Geweben. Veränderte DAAO‑Aktivität oder ‑Expression wurde im Kontext der Biologie neuropsychiatrischer und neurodegenerativer Erkrankungen sowie in breiteren Modellen oxidativer Schädigung und metabolischer Dysregulation untersucht.

DAAO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DAO-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DAAO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DAO-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DAO-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DAAO-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DAO-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DAAO-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DAAO-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DAO-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.