Cytokeratin 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402161-ACT

KRT3 kodiert für Zytokeratin 3, ein Typ-II-Intermediärfilamentprotein, das zusammen mit Keratin 12 das zentrale zytoskelettale Netzwerk differenzierter kornealer Epithelzellen bildet. Zytokeratin 3 trägt zur mechanischen Stabilität, zur Zellform und zur Widerstandsfähigkeit gegenüber Scherkräften bei, indem es in den Aufbau von Intermediärfilamenten eingebunden ist und mit desmosomen- und hemidesmosomenassoziierten Strukturen koordiniert. Seine Expression spiegelt Programme der Epithelreifung wider und ist mit Prozessen wie der Aufrechterhaltung der Barriere, der Wundreparatur und dem epithelialen Remodeling verknüpft. Fehlregulierte Keratin-Expressionsmuster, einschließlich veränderter KRT3-Expression, werden in experimentellen Modellen genutzt, um Differenzierungszustände des Hornhautepithels und Pathologien der okulären Oberfläche zu untersuchen.

Cytokeratin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KRT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cytokeratin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KRT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KRT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cytokeratin 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KRT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cytokeratin 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cytokeratin 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KRT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.