Cytokeratin 17 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402008-ACT

KRT17 kodiert Zytokeratin 17, ein Intermediärfilamentprotein vom Typ I, das sich mit Partnerkeratinen zu Filamenten zusammenlagert und so die strukturelle Integrität von Epithelzellen sowie ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischer Belastung unterstützt. Zytokeratin 17 wird während der Wundheilung und in hyperproliferativen Zuständen dynamisch reguliert und verknüpft dadurch den Umbau des Zytoskeletts mit Prozessen wie Keratinozytenaktivierung, Zellmigration und epithelialer Differenzierung. Eine veränderte KRT17-Expression wurde in entzündlichen wie auch neoplastischen Kontexten beschrieben, wo es häufig als Marker basaler bzw. aktivierter epithelialer Phänotypen verwendet wird. Als Bestandteil des Intermediärfilamentnetzwerks steht es in Wechselwirkung mit Signalprogrammen, die die zytoskelettale Organisation, zelluläre Stressantworten und die Gewebehomöostase koordinieren.

Cytokeratin 17 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KRT17-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cytokeratin 17 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KRT17-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KRT17-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cytokeratin 17-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KRT17-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cytokeratin 17-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cytokeratin 17-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KRT17-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.