Cytokeratin 10 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400193-ACT

KRT10 codifica la citocheratina 10, una proteina dei filamenti intermedi di tipo I che si associa alla cheratina 1 per formare la rete cheratinica soprastrata nei cheratinociti epidermici in via di differenziazione. Questo impalcato citoscheletrico sostiene la resistenza meccanica, si collega all’adesione desmosomiale e coordina i programmi di differenziazione terminale, inclusi la stratificazione e la formazione dell’involucro corneo. L’espressione di KRT10 è strettamente associata alla maturazione dei cheratinociti e a un controllo trascrizionale specifico di tessuto; alterazioni dell’omeostasi dei filamenti di cheratina possono compromettere l’integrità epiteliale e la segnalazione di stress. Variazioni genetiche e di espressione che coinvolgono KRT10 sono implicate in disturbi della differenziazione epidermica e nell’ipercheratosi, rappresentando un asse utile per studiare la biologia della barriera cutanea e i meccanismi delle patologie epiteliali.

Cytokeratin 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 10 nelle cellule tumorali con espressione di KRT10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.