Cytokeratin 10 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400193-ACT

KRT10 kodiert Zytokeratin 10, ein Intermediärfilamentprotein vom Typ I, das mit Keratin 1 paart, um in differenzierenden epidermalen Keratinozyten das suprabasale Keratinnetzwerk zu bilden. Dieses zytoskelettale Gerüst verleiht mechanische Widerstandsfähigkeit, ist an desmosomale Zelladhäsion gekoppelt und koordiniert Programme der terminalen Differenzierung, einschließlich Stratifikation und Bildung der verhornten Hülle (cornified envelope). Die KRT10-Expression ist eng an die Reifung von Keratinozyten sowie an gewebespezifische transkriptionelle Kontrolle gebunden, und Störungen der Homöostase von Keratinfilamenten können die Epithelintegrität und Stress-Signalwege verändern. Genetische und expressionsbezogene Veränderungen von KRT10 sind mit Erkrankungen der epidermalen Differenzierung und Hyperkeratose assoziiert und bieten damit eine nützliche Achse zur Untersuchung der Hautbarrierenbiologie und epithelialer Krankheitsmechanismen.

Cytokeratin 10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KRT10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cytokeratin 10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KRT10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KRT10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cytokeratin 10-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KRT10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cytokeratin 10-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cytokeratin 10-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KRT10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.