CYP7A1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401001-ACT

O CYP7A1 humano codifica a colesterol 7α-hidroxilase, uma enzima do citocromo P450 enriquecida no fígado que catalisa a primeira etapa — e limitante da velocidade — da via clássica de síntese de ácidos biliares a partir do colesterol. Ao controlar a conversão do colesterol em ácidos biliares primários, o CYP7A1 influencia a homeostase do colesterol, a sinalização entero-hepática e a regulação por feedback via receptores nucleares como o FXR e programas gênicos metabólicos a jusante. Alterações na atividade do CYP7A1 têm sido associadas a pools de ácidos biliares desregulados, suscetibilidade à hipercolesterolemia e fenótipos metabólicos que afetam a absorção de lipídios e o manejo de lipídios pelo fígado. Como um nó central no metabolismo de esteróis e ácidos biliares, o CYP7A1 é amplamente estudado na biologia de hepatócitos, na regulação metabólica e no crosstalk de vias com inflamação e respostas a xenobióticos.

CYP7A1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CYP7A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CYP7A1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CYP7A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CYP7A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CYP7A1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CYP7A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CYP7A1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CYP7A1 em células tumorais com expressão de CYP7A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.