CYP4F8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411598-ACT

Das humane CYP4F8 kodiert eine Cytochrom‑P450‑Monooxygenase, die zum oxidativen Stoffwechsel von aus Fettsäuren abgeleiteten Mediatoren beiträgt und damit die Regulation lokaler Lipidsignale sowie die Verarbeitung von Xenobiotika unterstützt. Als Teil der übergeordneten CYP4‑Familie ist CYP4F8 mit ω‑Hydroxylierungsreaktionen verknüpft, die den Umsatz von Eicosanoiden und den Entzündungsstatus beeinflussen können und dabei in Signalwege eingreifen, welche die epitheliale Homöostase und zelluläre Stressantworten steuern. Unterschiede in Aktivität und Expression von CYP450‑Enzymen werden häufig im Zusammenhang mit interindividuellen Unterschieden im Metabolismus und in der Anfälligkeit für entzündungsassoziierte Phänotypen untersucht, wodurch CYP4F8 ein nützliches Ziel in mechanistischen Studien ist. In‑vitro‑Modelle, die auf eine Modulation von CYP4F8 setzen, können helfen zu klären, wie der Stoffwechsel von Lipidmediatoren Signalnetzwerke prägt, die für gewebespezifische Physiologie relevant sind.

CYP4F8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP4F8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP4F8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP4F8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP4F8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP4F8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP4F8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP4F8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP4F8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP4F8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.