CYP2R1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404463-ACT

Das humane CYP2R1-Gen kodiert eine mikrosomale Cytochrom‑P450‑Monooxygenase, die als wichtigste 25‑Hydroxylase im Vitamin‑D‑Stoffwechsel fungiert und Cholecalciferol sowie Ergocalciferol im endoplasmatischen Retikulum zu 25‑Hydroxyvitamin D umwandelt. Dieser enzymatische Schritt ist zentral für Steroid‑ und Lipidoxidationswege und trägt über nachgeschaltete endokrine Vitamin‑D‑Signalwege zur systemischen Regulation der Calcium‑Phosphat‑Homöostase bei. Variationen oder eine verminderte Aktivität von CYP2R1 wurden mit niedrigen zirkulierenden 25‑Hydroxyvitamin‑D‑Spiegeln und damit verbundenen Phänotypen, die Knochen‑ und Mineralstoffwechsel betreffen, in Zusammenhang gebracht. CYP2R1 ist daher relevant für mechanistische Studien zur hepatischen Vitamin‑D‑Biotransformation, zur Redoxbiologie der Cytochrom‑P450‑Enzyme und zu Nährstoff‑Hormon‑Signalnetzwerken.

CYP2R1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP2R1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP2R1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP2R1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP2R1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP2R1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP2R1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP2R1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP2R1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP2R1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.