CYP2A7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403449-ACT

Humanes CYP2A7 kodiert eine Cytochrom‑P450‑Monooxygenase, die am oxidativen Stoffwechsel endogener Substrate und zahlreicher Xenobiotika innerhalb mikrosomaler Arzneistoff‑Metabolismusnetzwerke beteiligt ist. Als Mitglied der CYP2‑Familie ist CYP2A7 an Redoxzyklen mit der NADPH‑Cytochrom‑P450‑Reduktase gekoppelt und unterstützt Phase‑I‑Biotransformationsprozesse, die nachgeschaltete Konjugations‑ und Clearance‑Wege beeinflussen. Unterschiede in der Aktivität des CYP2A‑Lokus können die metabolische Kapazität und das Bioaktivierungspotenzial modulieren, wodurch es für Studien zur Chemikalienempfindlichkeit, zur Reaktion auf Toxikanten und zu interindividuellen Unterschieden im Stoffwechsel relevant ist. Die Expression von CYP2A7 wird daher häufig in der Leber und anderen stoffwechselaktiven Geweben untersucht, um die Regulation von Signalwegen unter physiologischen Bedingungen und unter Stressbedingungen einzuordnen.

CYP2A7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP2A7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP2A7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP2A7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP2A7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP2A7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP2A7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP2A7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP2A7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP2A7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.