Plasmide CRISPR d'Activation (m) cylindromatosis 1: sc-428814-ACT

Le gène murin *Cyld* code la cylindromatose 1, une enzyme déubiquitinante qui enlève préférentiellement les chaînes d’ubiquitine liées en K63 et en M1 afin d’atténuer la propagation du signal à partir de complexes proximaux aux récepteurs. CYLD agit comme régulateur négatif des voies NF-κB et MAPK en aval du récepteur du TNF, des récepteurs Toll-like et des voies des récepteurs antigéniques, influençant ainsi les programmes transcriptionnels inflammatoires, la survie cellulaire et les réponses au stress. Elle contribue également à la dynamique du cytosquelette et aux processus dépendants des microtubules, modulant la migration cellulaire et l’organisation tissulaire. Une activité ou une expression dérégulée de CYLD est associée à une signalisation immunitaire aberrante et à la biologie tumorale, ce qui en fait un nœud précieux pour étudier le contrôle, dépendant de l’ubiquitine, des réseaux de signalisation.

cylindromatosis 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cyld sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cylindromatosis 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cyld dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cyld, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cylindromatosis 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cyld natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cylindromatosis 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cylindromatosis 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cyld silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.