CUG2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417019-ACT

CENPW, auch bekannt als CUG2, kodiert einen zentralen, mit dem Zentromer assoziierten Faktor, der für den korrekten Aufbau des Kinetochors und die zuverlässige Chromosomensegregation während der Mitose erforderlich ist. CUG2 ist an der Organisation des zentromerischen Chromatins beteiligt und unterstützt die Integrität des Spindelkontrollpunkts; damit steht es in Zusammenhang mit der Zellzyklusprogression und der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Eine veränderte Expression von Zentromer- und Kinetochor-Komponenten ist häufig mit Aneuploidie und einer Dysregulation der Proliferation assoziiert, was CENPW zu einem geeigneten Knotenpunkt macht, um Mechanismen chromosomaler Instabilität zu untersuchen. In humanen Zellen wird eine Störung der CUG2-Funktion häufig im Kontext der mitotischen Kontrolle, von DNA-Schadensantworten auf Segregationsfehler sowie krebsrelevanter Proliferationsphänotypen untersucht.

CUG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CENPW-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CUG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CENPW-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CENPW-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CUG2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CENPW-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CUG2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CUG2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CENPW-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.