cubilin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402129-ACT

Das humane Gen **CUBN** kodiert **Cubilin**, einen großen multiliganden Endozytoserezeptor, der besonders stark im **proximalen Nierentubulus** sowie im **Darmepithel** exprimiert wird. Cubilin wirkt mit **Megalin (LRP2)** und dem Adapterprotein **Amnionless (AMN)** zusammen, um die rezeptorvermittelte Aufnahme und den lysosomalen Transport von proteingebundenen Nährstoffen zu vermitteln, darunter **Intrinsic-Factor–Vitamin‑B12‑Komplexe** und filtrierte Plasmaproteine wie **Albumin**. Über diese Endozytosewege trägt Cubilin zur Aufrechterhaltung der Nährstoffhomöostase bei und reguliert die tubuläre Rückresorption von Proteinen, wodurch seine Funktion mit epithelialem Transport und Netzwerken der vesikelvermittelten Internalisierung verknüpft ist. Eine Störung oder Fehlregulation von **CUBN** ist mit einer beeinträchtigten Vitamin‑B12‑Aufnahme und Phänotypen der renalen tubulären Proteinverarbeitung assoziiert und ist daher relevant für mechanistische Studien zur Biologie von Nieren- und gastrointestinalen Erkrankungen.

cubilin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CUBN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cubilin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CUBN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CUBN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cubilin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CUBN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cubilin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cubilin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CUBN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.