CstF-64 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402202-ACT

CSTF2 kodiert CstF-64, eine RNA-bindende Untereinheit des Cleavage Stimulation Factor (CstF)-Komplexes, der GU-/U-reiche, nachgeschaltete Sequenzelemente erkennt und so die 3′-Endspaltung und Polyadenylierung von prä-mRNA fördert. Durch die Steuerung der Wahl alternativer Polyadenylierungsstellen beeinflusst CstF-64 die Länge der 3′-UTR, die mRNA-Stabilität, die Translationseffizienz und die Lokalisation von Transkripten und ist damit an der globalen Regulation der Genexpression während Proliferation und Differenzierung beteiligt. Die CSTF2-abhängige Polyadenylierung überschneidet sich mit Transkriptions-Termination und RNA-Prozessierungswegen, beeinflusst die Isoformenvielfalt und posttranskriptionelle regulatorische Netzwerke. Eine Fehlregulation alternativer Polyadenylierung und der 3′-End-Prozessierung ist mit veränderten onkogenen und entwicklungsbezogenen Genprogrammen assoziiert, wodurch CSTF2 zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der RNA-Reifung und krankheitsassoziierten Transkriptom-Umgestaltung wird.

CstF-64 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CSTF2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CstF-64 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CSTF2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CSTF2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CstF-64-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CSTF2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CstF-64-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CstF-64-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CSTF2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.