creatine kinase-M CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401132-ACT

Das humane Gen **CKM** kodiert die Kreatinkinase M, eine zytosolische Phosphagen-Kinase, die die reversible Übertragung von Phosphat zwischen ATP und Kreatin katalysiert und so Phosphokreatin erzeugt. Dadurch puffert sie zelluläres ATP und unterstützt einen schnellen Energieumsatz. CKM ist eng mit der Bioenergetik der quergestreiften Muskulatur verbunden und trägt während der Kontraktion zur metabolischen Homöostase bei, indem es den Energiebedarf mit der Glykolyse und der oxidativen Phosphorylierung verknüpft. Veränderte CKM-Expression oder -Aktivität wird häufig im Zusammenhang mit Muskelverletzungen, Myopathien und metabolischem Stress untersucht, da die Phosphokreatin-Dynamik Veränderungen der mitochondrialen Funktion und der zellulären Energetik widerspiegeln kann. Als Marker für Muskel-Linienzugehörigkeit und Energiestoffwechsel wird CKM zudem genutzt, um in Modellsystemen den Differenzierungszustand, die sarkomerische Organisation und metabolisches Remodeling zu untersuchen.

creatine kinase-M Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CKM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

creatine kinase-M Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CKM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CKM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen creatine kinase-M-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CKM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von creatine kinase-M-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des creatine kinase-M-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CKM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.