Plásmido CRISPR de Activación (h) cPLA₂: sc-400678-ACT

PLA2G4A codifica la fosfolipasa A2 citosólica alfa (cPLA2), una enzima dependiente de calcio y regulada por fosforilación que hidroliza de forma selectiva los fosfolípidos de membrana para liberar ácido araquidónico. Esta reacción aporta sustrato para la biosíntesis de eicosanoides a través de las vías de la ciclooxigenasa y la lipooxigenasa, vinculando la actividad de cPLA2 con la producción de prostaglandinas y leucotrienos durante la señalización inflamatoria. cPLA2 integra señales de MAPK/ERK y de otras cascadas de quinasas sensibles al estrés para coordinar la generación de mediadores lipídicos, la remodelación de membranas y el tráfico vesicular. La desregulación de la señalización de PLA2G4A se ha asociado con estados inflamatorios crónicos, patología vascular y la biología del microambiente asociado a tumores, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos de redes de señalización impulsadas por lípidos.

cPLA2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PLA2G4A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cPLA2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PLA2G4A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PLA2G4A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cPLA2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PLA2G4A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cPLA2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cPLA2 en células tumorales con expresión de PLA2G4A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.