CPE CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404429-ACT

Carboxypeptidase E (CPE) ist eine zinkabhängige Exopeptidase, die C‑terminale basische Aminosäurereste von Vorstufen peptidischer Hormone und Neuropeptide abspaltet und so die Reifung bioaktiver sekretorischer Peptide unterstützt. In neuroendokrinen und endokrinen Zellen wirkt CPE innerhalb des regulierten Sekretionswegs und ist mit der Vesikelsortierung sowie der Biogenese dichtkerniger Granula verknüpft, wodurch es den Peptidtransport und die reizgekoppelte Sekretion beeinflusst. Indem CPE die Verfügbarkeit von Signaling-Peptiden mitbestimmt, wirkt es auf Signalwege ein, die Stoffwechsel, neuronale Kommunikation und Stressantworten steuern. Eine veränderte CPE-Expression oder -Aktivität wurde mit neuroendokrinen Funktionsstörungen und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was CPE zu einem relevanten Ziel für Studien zu Netzwerken der Peptidprozessierung und zur Regulation des sekretorischen Weges macht.

CPE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CPE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CPE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CPE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CPE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CPE-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CPE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CPE-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CPE-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CPE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.