Contactin 3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422111-ACT

Cntn3 kodiert Contactin 3, ein über einen Glycosylphosphatidylinositol-(GPI)-Anker membrangebundenes Zelladhäsionsmolekül der Immunglobulin-Superfamilie, das im Nervensystem angereichert ist. Contactin 3 trägt zum Neuritenauswuchs, zur Axonführung und zur Organisation von Synapsen bei, indem es die Zell-Zell-Erkennung an der neuronalen Oberfläche vermittelt und während Entwicklung und Reifung die Konnektivität formt. Über seine Adhäsions- und Gerüstfunktionen ist CNTN3 in Signalwege eingebunden, die die Membranorganisation, den Aufbau neuronaler Schaltkreise und die aktivitätsabhängige Plastizität regulieren. Eine veränderte Signalgebung der CNTN-Familie wurde mit neuroentwicklungsbedingten und neuropsychiatrischen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch Cntn3 ein relevantes Ziel für mechanistische Studien zur Verschaltung des Gehirns und zur synaptischen Funktion in Mausmodellen ist.

Contactin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cntn3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Contactin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cntn3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cntn3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Contactin 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cntn3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Contactin 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Contactin 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cntn3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.