connexin 36 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402740-ACT

GJD2 codifica a conexina 36 (Cx36), uma proteína de junções comunicantes (gap junctions) que se organiza em canais intercelulares, permitindo o acoplamento elétrico e metabólico direto entre células adjacentes. O acoplamento mediado pela Cx36 favorece disparos sincronizados e oscilações de rede, especialmente em circuitos neuronais, ao permitir fluxo iônico rápido e a troca de pequenas moléculas através das membranas. No sistema nervoso central e em outros tecidos excitáveis, a conexina 36 influencia a integração sináptica, a propagação de sinais e a plasticidade dependente de atividade por meio da regulação da montagem e do gating (abertura/fechamento) das junções comunicantes. Alterações na expressão ou no acoplamento de GJD2/conexina 36 têm sido implicadas em disfunções neurofisiológicas e são estudadas no contexto de transtornos que envolvem sincronia neuronal prejudicada.

connexin 36 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GJD2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

connexin 36 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GJD2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GJD2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de connexin 36. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GJD2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de connexin 36 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via connexin 36 em células tumorais com expressão de GJD2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.