COL4A4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404186-ACT

COL4A4 kodiert die Kollagen‑Typ‑IV‑Alpha‑4‑Kette, eine zentrale strukturelle Komponente von Basalmembranen, die sich zu heterotrimeren Typ‑IV‑Kollagen‑Netzwerken assemblieren, welche epitheliale und endotheliale Grenzflächen stützen. Diese Netzwerke regulieren die Organisation der extrazellulären Matrix, Zelladhäsion, Polarität und die Barrierefunktion von Geweben und beeinflussen Signalprozesse wie integrinvermittelte Signalwege sowie matrixabhängige Mechanotransduktion. In der glomerulären Basalmembran der Niere trägt COL4A4 zur Filtrationsarchitektur und zur Stabilität der Matrix bei; eine veränderte COL4A4‑Funktion ist mit erblichen Nephropathien verbunden, darunter Erkrankungen aus dem Alport‑Spektrum und Phänotypen einer dünnen Basalmembran. Eine Dysregulation der Zusammensetzung von Typ‑IV‑Kollagen wirkt sich zudem auf vaskuläre und epitheliale Mikroumgebungen aus, was für die Fibrose‑ und Gewebe‑Remodeling‑Forschung relevant ist.

COL4A4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen COL4A4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

COL4A4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des COL4A4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der COL4A4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen COL4A4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native COL4A4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von COL4A4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des COL4A4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem COL4A4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.