COL1A1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400064-ACT

COL1A1 kodiert die Pro-α1-Kette von Typ-I-Kollagen, einem wichtigen fibrillären Bestandteil der extrazellulären Matrix, der sich zu Heterotrimeren zusammensetzt und dem Bindegewebe Zugfestigkeit verleiht. Seine Biosynthese umfasst die Prozessierung im ER, die Hydroxylierung von Prolin/Lysin, die Ausbildung der Tripelhelix, die Sekretion sowie die extrazelluläre Quervernetzung und ist in die ECM-Organisation, die Signalübertragung über fokale Adhäsionen und TGF-β‑gesteuerte fibrogene Programme eingebunden. Die COL1A1-Expression ist während der Wundheilung und des stromalen Remodelings streng reguliert und wird häufig als Readout für Fibroblastenaktivierung und Matrixablagerung verwendet. Eine fehlregulierte COL1A1-Expression trägt zu pathologischer Fibrose und tumorassoziierter Desmoplasie bei; Keimbahn-Defekte in Typ-I-Kollagen sind zudem mit erblichen Bindegewebserkrankungen verknüpft.

COL1A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen COL1A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

COL1A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des COL1A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der COL1A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen COL1A1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native COL1A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von COL1A1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des COL1A1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem COL1A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.