Plásmido CRISPR de Activación (h) CNOT1: sc-403431-ACT

El CNOT1 humano codifica un andamiaje central del complejo CCR4–NOT, un regulador multisubunidad de la expresión génica que acopla el control transcripcional con la desadenilación, el descapado y la degradación del mRNA. Al coordinar el reclutamiento y la actividad de desadenilasas e interactuar con proteínas de unión a RNA y con la maquinaria efectora de microRNA, CNOT1 contribuye a determinar la estabilidad de los transcritos y la eficiencia de traducción en diversos programas celulares. Esta regulación es esencial para la progresión del ciclo celular, la diferenciación, las respuestas al estrés y el mantenimiento de la proteostasis mediante efectos amplios sobre el recambio de mRNA. La desregulación de componentes de CCR4–NOT, incluido CNOT1, se ha asociado con alteraciones de la homeostasis del RNA y de los programas transcripcionales observados en la biología del cáncer y en fenotipos del neurodesarrollo, lo que respalda su relevancia en estudios mecanísticos de redes de regulación génica vinculadas a enfermedades.

CNOT1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CNOT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CNOT1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CNOT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CNOT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CNOT1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CNOT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CNOT1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CNOT1 en células tumorales con expresión de CNOT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.