CLN2 Double Nickaseプラスミド (h): sc-405204-NIC

TPP1は、リソソームのセリンプロテアーゼであるトリペプチジルペプチダーゼ1（CLN2）をコードしており、ポリペプチドのN末端からトリペプチドを切り出すことで、リソソームにおけるタンパク質のターンオーバーと細胞のプロテオスタシス維持を支えます。CLN2の機能は、エンドソーム—リソソーム輸送、オートファジー—リソソーム経路、ならびに分解対象基質の異化的プロセシングと統合的に関わっています。TPP1の欠失または機能不全はリソソーム恒常性を乱し、未分解物質の蓄積を促進し、リソソーム貯蔵病理のモデルにおいて神経細胞およびグリア細胞のレジリエンスを損ないます。したがって、TPP1/CLN2は、リソソーム依存的なクリアランス経路や疾患関連の細胞ストレス応答を研究するための機構的な導入点として広く用いられています。

CLN2 ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における TPP1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、TPP1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、TPP1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、TPP1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。