Plasmide CRISPR d'Activation (h) CLC-2: sc-403513-ACT

Le gène humain **CLCN2** code le canal chlore voltage-dépendant **CLC-2**, un transporteur des membranes plasmique et endomembranaires qui contribue à la conductance des ions chlorure, à la stabilisation du potentiel de membrane et à l’homéostasie ionique et hydrique des épithéliums. L’activité de CLC-2 participe aux processus de transport transépithélial et s’articule avec des programmes de signalisation où le chlorure intracellulaire agit comme régulateur du contrôle du volume cellulaire et de l’excitabilité électrique. Dans le système nerveux, CLC-2 influence la gestion du chlorure, pouvant moduler la neurotransmission inhibitrice en ajustant les gradients de chlorure cellulaires. Une expression dérégulée de **CLCN2** ou une altération de la fonction du canal a été associée à des phénotypes neurologiques et à une leucoencéphalopathie, et ce gène est également pertinent pour l’étude de la physiologie des barrières épithéliales et des troubles du transport ionique.

CLC-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CLCN2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CLC-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CLCN2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CLCN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CLC-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CLCN2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CLC-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CLC-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CLCN2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.