Plasmide CRISPR d'Activation (h) Clathrin Heavy Chain/CLTC: sc-400863-ACT

CLTC code la chaîne lourde de la clathrine, un composant structural central des puits et vésicules recouverts de clathrine, qui coordonne la courbure membranaire et la sélection des cargos lors de l’endocytose médiée par la clathrine. Grâce à ses interactions avec les complexes de protéines adaptatrices et des facteurs accessoires, CLTC régule l’internalisation des récepteurs, le recyclage des vésicules synaptiques, le trafic endosomal et le transport au niveau du réseau trans-Golgi, modulant ainsi la signalisation en aval et l’absorption des nutriments. Cette voie influence l’homéostasie des récepteurs à tyrosine kinase, des RCPG (récepteurs couplés aux protéines G) et des récepteurs immunitaires, reliant l’activité de CLTC à des réseaux de signalisation impliqués dans la prolifération et la réponse au stress. Des altérations génétiques et une dérégulation du trafic dépendant de la clathrine ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et à des réarrangements liés à des cancers impliquant CLTC, ce qui étaye des études mécanistiques des défauts de transport vésiculaire dans des modèles de maladie.

Clathrin Heavy Chain/CLTC Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CLTC sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Clathrin Heavy Chain/CLTC Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CLTC dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CLTC, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Clathrin Heavy Chain/CLTC. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CLTC natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Clathrin Heavy Chain/CLTC au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Clathrin Heavy Chain/CLTC dans les cellules tumorales présentant une expression de CLTC silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.