Plasmide CRISPR d'Activation (h) CKR-5: sc-402548-ACT

CCR5 code pour le récepteur humain de chimiokines CKR-5, un RCPG à sept domaines transmembranaires exprimé majoritairement par les lymphocytes T, les macrophages et les cellules dendritiques, où il se lie à des ligands tels que CCL3, CCL4 et CCL5 afin d’orienter la chimiotaxie des leucocytes. La signalisation de CKR-5 mobilise des protéines G hétérotrimériques pour activer des voies incluant PI3K/AKT, un flux calcique dépendant de PLCβ, MAPK/ERK, ainsi que le remodelage du cytosquelette, qui coordonnent la migration cellulaire et les réponses inflammatoires. Par son rôle dans le trafic et l’activation des cellules immunitaires, CCR5 est largement étudié dans l’inflammation et la surveillance immunitaire des tissus, et des différences génétiques ou d’expression ont été associées à des variations de susceptibilité et de progression dans de multiples contextes de maladies infectieuses et immunomédiées. Dans les systèmes expérimentaux, l’expression de CCR5 est souvent utilisée comme marqueur de la signalisation médiée par le récepteur, de la détection de gradients de chimiokines et de la modulation du comportement des cellules myéloïdes et lymphoïdes.

CKR-5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCR5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CKR-5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCR5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCR5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CKR-5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCR5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CKR-5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CKR-5 dans les cellules tumorales présentant une expression de CCR5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.