Plásmido CRISPR de Activación (h) Chx10: sc-401103-ACT

VSX2 (Chx10) codifica un factor de transcripción tipo homeobox paired-like que regula la proliferación de las células progenitoras de la retina, la especificación del destino neuronal y la diferenciación de interneuronas bipolares durante el desarrollo del ojo humano. Chx10 integra redes reguladoras de genes del desarrollo al unirse a elementos cis-reguladores y coordinar programas transcripcionales que influyen en la progresión del ciclo celular y el compromiso de linaje en la neurorretina. La actividad alterada de VSX2 se asocia con malformaciones oculares congénitas y defectos del neurodesarrollo que afectan la estructura y la función de la retina, lo que lo convierte en un nodo relevante para estudiar los mecanismos del desarrollo ocular y la identidad celular retiniana. In vitro, la modulación de VSX2 se utiliza habitualmente para investigar los circuitos transcripcionales en organoides retinianos y linajes retinianos derivados de células madre.

Chx10 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VSX2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Chx10 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VSX2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VSX2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Chx10. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VSX2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Chx10 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Chx10 en células tumorales con expresión de VSX2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.