Plasmide CRISPR d'Activation (h) chordin: sc-404997-ACT

Le gène humain **CHRD** code la **chordin**, une glycoprotéine sécrétée riche en cystéines qui antagonise la signalisation **BMP** en se liant aux ligands BMP dans l’espace extracellulaire et en limitant leur interaction avec les récepteurs. En modulant l’activité des voies **BMP/TGF-β**, la chordin contribue à réguler la mise en place des axes embryonnaires, la spécification mésodermique et la morphogenèse tissulaire, avec des effets en aval sur les programmes transcriptionnels médiés par **SMAD**. Une expression dérégulée de **CHRD** ou une antagonisation altérée des BMP a été associée à des anomalies du développement ainsi qu’à des processus de remodelage liés à des maladies, dans lesquels les gradients de BMP influencent le destin cellulaire, la différenciation et l’organisation de la matrice extracellulaire. **CHRD** est donc pertinent pour l’étude de la dynamique des signaux morphogénétiques, de l’engagement de lignée et de la modulation contextuelle de la voie BMP dans les cellules humaines.

chordin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHRD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

chordin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHRD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHRD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de chordin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHRD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de chordin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie chordin dans les cellules tumorales présentant une expression de CHRD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.