CHMP4A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402539-ACT

Humanes CHMP4A kodiert eine zentrale Komponente der ESCRT-III-Maschinerie, die Membranen umformt und dadurch die Bildung intraluminaler Vesikel während der Biogenese multivesikulärer Körperchen sowie die Sortierung endosomaler Fracht antreibt. CHMP4A ist außerdem an der Zytokinese, insbesondere an der finalen Abtrennung (Abszission), beteiligt und hilft, Membranabschnürungsereignisse zu koordinieren, die für die Reparatur der Plasmamembran und die Herunterregulierung von Rezeptoren wichtig sind. Über diese Funktionen beeinflusst CHMP4A die Proteostase und die Abschwächung von Signalwegen, einschließlich der trafficking-abhängigen Kontrolle von Ausgaben (Outputs) von Wachstumsfaktorrezeptoren. Eine dysregulierte ESCRT-Funktion wird breit mit onkogenem Signaling, neurodegenerativen Prozessen und einer erhöhten Anfälligkeit für Pathogene in Verbindung gebracht, die ESCRT-abhängiges Budding ausnutzen; damit ist CHMP4A ein nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Membranremodellierung.

CHMP4A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHMP4A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CHMP4A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHMP4A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHMP4A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CHMP4A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHMP4A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CHMP4A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CHMP4A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHMP4A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.