Chitotriosidase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402112-ACT

CHIT1 kodiert Chitotriosidase, eine sekretierte und lysosomale Glykosid-Hydrolase, die überwiegend von aktivierten Makrophagen und anderen myeloiden Zellen exprimiert wird. Obwohl Menschen kein Chitin synthetisieren, ist CHIT1 an angeborenen Immunantworten beteiligt, indem es chitin-containing Strukturen von Pilzen und Parasiten erkennt und abbaut, und steht mit der Polarisierung von Makrophagen, der lysosomalen Funktion sowie entzündlichen Signalprogrammen in Zusammenhang. Veränderte CHIT1-Expression und enzymatische Aktivität wurden mit Erkrankungen assoziiert, die durch Makrophagenaktivierung und Gewebeumbau gekennzeichnet sind, darunter lysosomale Speicherkrankheiten und chronisch-entzündliche Zustände. Als Marker myeloider Aktivierung wird CHIT1 häufig im Kontext von Wirt–Pathogen-Interaktionen, granulomatösen Entzündungen und fibrotischen Mikroumgebungen untersucht.

Chitotriosidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHIT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Chitotriosidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHIT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHIT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Chitotriosidase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHIT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Chitotriosidase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Chitotriosidase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHIT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.