CH25H CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419641-ACT

Ch25h kodiert die Cholesterin-25-Hydroxylase (CH25H), ein mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiertes Enzym, das Cholesterin zu 25‑Hydroxycholesterin umwandelt – einem bioaktiven Oxysterol, das die Sterolhomöostase und die Lipidzusammensetzung von Membranen moduliert. Über die Regulation der SREBP-gesteuerten Cholesterinbiosynthese und LXR-abhängiger Transkriptionsprogramme beeinflusst CH25H den Lipidstoffwechsel, den vesikulären Transport und entzündliche Signalwege. In Immunzellen der Maus ist Ch25h durch angeborene Immunreize induzierbar und kann Aktivierungszustände von Makrophagen und Mikroglia prägen, indem es oxysterolvermittelte Signalnetzwerke verändert. Eine fehlregulierte CH25H-Aktivität und eine veränderte Produktion von 25‑Hydroxycholesterin wurden mit aberranten Entzündungsreaktionen und Stoffwechselstress-Signalwegen in Verbindung gebracht, wodurch Ch25h einen geeigneten Ansatzpunkt darstellt, um immunmetabolisches Crosstalk in krankheitsrelevanten Modellen zu untersuchen.

CH25H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ch25h-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CH25H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ch25h-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ch25h-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CH25H-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ch25h-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CH25H-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CH25H-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ch25h-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.