Plasmide CRISPR d'Activation (h) CDKN1B/Kip1 p27: sc-400074-ACT

CDKN1B code p27^Kip1, un inhibiteur de kinases dépendantes des cyclines qui freine la progression à travers le point de contrôle G1/S pilotée par CDK2 et CDK4/6, en modulant les complexes cycline E/A–CDK2 et cycline D–CDK4/6. p27 intègre des signaux mitogènes et antiprolifératifs en aval de voies telles que PI3K–AKT et TGF-β, et son abondance est étroitement contrôlée par une ubiquitination dépendante de la phosphorylation et une dégradation protéasomale. Par ces mécanismes, CDKN1B influence les programmes de prolifération, de quiescence et de différenciation dans divers types cellulaires. Une expression altérée de CDKN1B ou une mauvaise localisation de la protéine est fréquemment associée à une dérégulation du contrôle du cycle cellulaire en oncologie, ainsi qu’à des perturbations dans des contextes endocriniens et du développement.

CDKN1B/Kip1 p27 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDKN1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CDKN1B/Kip1 p27 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDKN1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDKN1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CDKN1B/Kip1 p27. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDKN1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CDKN1B/Kip1 p27 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CDKN1B/Kip1 p27 dans les cellules tumorales présentant une expression de CDKN1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.